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當(dāng)前位置:首頁技術(shù)文章骨關(guān)節(jié)炎動(dòng)物模型

骨關(guān)節(jié)炎動(dòng)物模型

更新時(shí)間:2019-01-16點(diǎn)擊次數(shù):3649

骨關(guān)節(jié)炎(osteoarthritis, OA)是中老年人常見的一種慢性進(jìn)行性疾病。是由于關(guān)節(jié)軟骨退行性改變(退變)和關(guān)節(jié)表面邊緣形成新骨的退行性病變,其病因、分子生物學(xué)、早期診斷和治療均存在問題,需要進(jìn)一步研究。骨關(guān)節(jié)炎動(dòng)物模型無疑是研究人類骨關(guān)節(jié)炎病理機(jī)制和防治方法的良好工具。骨關(guān)節(jié)炎動(dòng)物模型有的是自發(fā)的,也可通過關(guān)節(jié)制動(dòng)、手術(shù)改變關(guān)節(jié)應(yīng)力、破壞關(guān)節(jié)血液循環(huán)、關(guān)節(jié)內(nèi)藥物注射、關(guān)節(jié)內(nèi)植入軟骨碎片等方法建立。

1 自發(fā)性動(dòng)物模型

(1)C57BL小鼠  自從20世紀(jì)40年代Silberberg先發(fā)現(xiàn)C57BL小鼠具有骨關(guān)節(jié)炎特征以來,有研究報(bào)道已經(jīng)對(duì)C57BL小鼠的這種特征進(jìn)行了動(dòng)態(tài)病理組織學(xué)研究。該小鼠3個(gè)月齡時(shí)關(guān)節(jié)軟骨基質(zhì)中糖胺聚糖染色性降低;6個(gè)月齡時(shí)60%小鼠關(guān)節(jié)軟骨可出現(xiàn)Ⅰ度骨關(guān)節(jié)炎改變,主要表現(xiàn)為半月板游離緣附近的關(guān)節(jié)軟骨表面不平整,排列在表層的扁平軟骨細(xì)胞脫落、消失,軟骨下骨小梁密度改變;18個(gè)月齡時(shí)小鼠均可出現(xiàn)Ⅰ度以上的骨關(guān)節(jié)炎改變,其中18%的小鼠出現(xiàn)Ⅱ度骨關(guān)節(jié)炎改變,9%出現(xiàn)Ⅲ度骨關(guān)節(jié)炎改變。該自發(fā)性模型與人類骨關(guān)節(jié)炎的差異主要表現(xiàn)為,其沒有關(guān)節(jié)軟骨的微纖維化,關(guān)節(jié)軟骨剝離脫落呈腐蝕狀,軟骨細(xì)胞無集簇及骨刺形成,滑膜炎癥不明顯;骨關(guān)節(jié)炎進(jìn)程中不伴有糖胺聚糖和DNA合成增加。表明該小鼠軟骨的自我修復(fù)功能缺乏或受到抑制。已有研究證實(shí),給 C57BL小鼠飼喂高脂飼料,可加速其關(guān)節(jié)的退行性病變。

(2)豚鼠  已往研究報(bào)道證實(shí),12月齡后的豚鼠在股骨內(nèi)側(cè)髁中央可出現(xiàn)與人類骨關(guān)節(jié)炎相似的病理變化,且病理變化隨年齡增長(zhǎng)而逐漸加重;而外側(cè)髁無明顯變化。豚鼠骨關(guān)節(jié)炎病程發(fā)展過程緩慢,與臨床上人類骨關(guān)節(jié)炎極為相似,且其軟骨基質(zhì)病變程度與負(fù)荷呈正相關(guān)。

2 誘發(fā)性動(dòng)物模型

2.1 機(jī)械制動(dòng)模型

當(dāng)模型動(dòng)物的下肢關(guān)節(jié)機(jī)械制動(dòng)一段時(shí)間后,局部不論是否施以外加壓力,關(guān)節(jié)軟骨均可出現(xiàn)與臨床相似的退行性改變,且不論采用伸直位、屈曲位或中間位。研究發(fā)現(xiàn)家兔膝關(guān)節(jié)制動(dòng)60d后,由制動(dòng)所造成的大部分關(guān)切軟骨的變化無法逆轉(zhuǎn)。若制動(dòng)不超過30d,電鏡下關(guān)節(jié)表面的圓形突起未破壞,切線層纖維束未暴露,病變則有恢復(fù)的可能。若制動(dòng)時(shí)間超過30d,則可導(dǎo)致關(guān)節(jié)的進(jìn)行性破壞。若以屈曲位制動(dòng),則因減少了橫跨膝關(guān)節(jié)的肌肉的收縮,可導(dǎo)致關(guān)節(jié)骨的萎縮性變化;若以伸直位制動(dòng),則限制了關(guān)節(jié)的運(yùn)動(dòng)、肌肉、關(guān)節(jié)囊收縮,對(duì)關(guān)節(jié)面產(chǎn)生了過度壓力,可導(dǎo)致0A的發(fā)生。實(shí)驗(yàn)研究進(jìn)一步表明,短于4d的關(guān)節(jié)制動(dòng),即具有的病理積累作用,無論是短期的反復(fù)制動(dòng)或是持續(xù)制動(dòng)。 Okazaki等實(shí)驗(yàn)研究也表明,家兔膝關(guān)節(jié)伸直位制動(dòng)7~14d后,關(guān)節(jié)軟骨即出現(xiàn)早期退變,28d后出現(xiàn)關(guān)節(jié)軟骨中度退變,42d后則出現(xiàn)嚴(yán)重的退變,并發(fā)現(xiàn)P53mRNA在此過程中發(fā)揮了重要作用。故有人認(rèn)為將兔膝關(guān)節(jié)于伸直位制動(dòng)5~6周,即可得到0A動(dòng)物模型。

2.2 手術(shù)方法制作骨關(guān)節(jié)炎模型

(1)復(fù)制方法  取膝內(nèi)側(cè)切口切除家兔髕下脂肪墊后,沿髕骨內(nèi)外緣切除關(guān)節(jié)囊及滑膜各一條組織(10mm×5mm),然后作鼠蹊切口游離髂外和骨靜脈,結(jié)扎并切除1.5cm的血管,術(shù)后家兔自由活動(dòng)。

(2)模型特點(diǎn)  術(shù)后30d,光鏡見髕骨表面近遠(yuǎn)兩端有丘狀新生骨形成,并伸入腱附著區(qū)內(nèi),為編織狀骨;髕骨關(guān)節(jié)中,髕軟骨的軟骨細(xì)胞層次清楚、完整,但髕骨近遠(yuǎn)端處軟骨變薄,層次紊亂,有的部位只見纖維組織覆蓋于松質(zhì)骨表面;術(shù)后60d,髕骨表面新生骨漸趨成熟;術(shù)后90d,新生骨表面發(fā)育為正常骨皮質(zhì),其下面出現(xiàn)骨髓腔,新生骨下原髕骨皮質(zhì)內(nèi)髓腔化明顯。術(shù)后60d,股四頭肌腱和髕腱內(nèi)出現(xiàn)肥大、核圓的軟骨細(xì)胞,基質(zhì)無鈣化,90d時(shí)形成片狀軟骨灶。

(3)比較醫(yī)學(xué)  骨關(guān)節(jié)炎的發(fā)生機(jī)制復(fù)雜,一般認(rèn)為是多因素綜合所致。繼發(fā)性骨關(guān)節(jié)炎中,關(guān)節(jié)應(yīng)力的改變及關(guān)節(jié)局部血供的異常是重要原因。因此,運(yùn)用使關(guān)節(jié)失穩(wěn)或改變應(yīng)力或減少關(guān)節(jié)血供造成靜脈回流不暢,均可造成與臨床相似骨關(guān)節(jié)炎模型。但不同種動(dòng)物及不同方法造成的骨關(guān)節(jié)炎模型,其病理表現(xiàn)不盡一致。如鼠的關(guān)節(jié)幾何形狀與人類并不相同,此外小鼠軟骨中不含硫酸角質(zhì)素,而人類關(guān)節(jié)軟骨內(nèi)此物質(zhì)隨年齡增加而增多;如以大鼠或小鼠等嚙齒類動(dòng)物作為模型,則分析實(shí)驗(yàn)結(jié)果時(shí)應(yīng)考慮上述差異。研究骨關(guān)節(jié)炎的病理進(jìn)程、組織病理特征或軟骨生化代謝的變化,通常情況下可選用犬或兔作為模型動(dòng)物。

常用骨關(guān)節(jié)炎動(dòng)物模型手術(shù)方法分類:

1)破壞關(guān)節(jié)穩(wěn)定性  破壞關(guān)節(jié)穩(wěn)定性是目前國(guó)外常采用的一種OA造模方法。關(guān)節(jié)穩(wěn)定性是保持關(guān)節(jié)正常結(jié)構(gòu)和功能的一個(gè)重要因素。若關(guān)節(jié)不穩(wěn),必使關(guān)節(jié)各結(jié)構(gòu)的動(dòng)態(tài)平衡失調(diào),從而使關(guān)節(jié)發(fā)生退行性改變。常用的造成關(guān)節(jié)不穩(wěn)的手術(shù)方法主要包括:切斷內(nèi)側(cè)副韌帶、切斷前、后交叉韌帶,切除內(nèi)側(cè)半月板及切除髁、臏骨等。McDevitt等切除犬、兔前交叉或前后交叉韌帶、切斷家兔前交叉韌帶和內(nèi)側(cè)半月板造成關(guān)節(jié)失穩(wěn),手術(shù)后見關(guān)節(jié)滑膜增厚,軟骨表面糜爛,細(xì)胞成簇排列,骨贅形成,關(guān)節(jié)軟骨中黏蛋白減少,酸性磷酸酶增加,蛋白、糖胺聚糖(GAG)合成率增加,膠原纖維成分無變化,軟骨細(xì)胞合成的黏蛋白中含有更多的硫酸軟骨素。切斷雙后肢內(nèi)側(cè)副韌帶及膝前內(nèi)側(cè)筋膜擴(kuò)張部,并在斷端處修剪去除約2mm,造成小鼠雙后肢外翻畸形,術(shù)后2d放于拖箱內(nèi),每天趕其行走30m,2周后,光鏡見軟骨厚度變薄,電鏡軟骨細(xì)胞有明顯的外形改變,表明軟骨細(xì)胞處失代償期;造模4周,軟骨厚度顯著變薄,電鏡見軟骨細(xì)胞變形嚴(yán)重呈不規(guī)則狀,胞質(zhì)內(nèi)充滿脂滴、糖原顆粒及微絲,細(xì)胞器外形模糊,細(xì)胞核深度凹陷變形,細(xì)胞旁出現(xiàn)嗜鋨性脂肪碎屑,基質(zhì)內(nèi)膠原纖維顯露明顯且較正常為粗,結(jié)構(gòu)松散紊亂;手術(shù)8周,病變與人4周相似,但程度加重。路氏等將切除韌帶與半月板結(jié)合,成功地誘發(fā)膝關(guān)節(jié)骨關(guān)節(jié)炎,且認(rèn)為該模型制作期限合理,病灶典型。術(shù)后3周就出現(xiàn)了骨關(guān)節(jié)炎的早期改變,包括軟骨細(xì)胞排列紊亂,表層輕度糜爛,可見散在的軟骨細(xì)胞簇及局部潰瘍。術(shù)后6周出現(xiàn)了明顯的骨關(guān)節(jié)炎癥改變,6周X線顯示了關(guān)節(jié)間隙異常及脛骨上端變形。從而表明關(guān)節(jié)的不穩(wěn)定是造成關(guān)節(jié)軟骨破壞,形成骨關(guān)節(jié)炎的原因。將鼠或兔內(nèi)側(cè)半月板切除30%~50%,同時(shí),讓其自由活動(dòng),成功地復(fù)制出OA模型,且認(rèn)為這種造模方法對(duì)研究OA關(guān)節(jié)軟骨細(xì)胞凋亡是一種很好的動(dòng)物模型。而 Mansour等采用半月板部分切除和交叉韌帶切除術(shù)后造成動(dòng)物OA模型進(jìn)行研究發(fā)現(xiàn),改變兔膝關(guān)節(jié)動(dòng)力裝置在實(shí)驗(yàn)動(dòng)物OA產(chǎn)生過程中并不是起關(guān)鍵的作用。

2)降低關(guān)節(jié)應(yīng)力  研究表明在OA的發(fā)生機(jī)制中,缺乏負(fù)重可能是重要環(huán)節(jié)之一。由低應(yīng)力導(dǎo)致的軟骨退變?cè)缙?,軟骨?xì)胞缺乏骨退變中常見的代償性增生表現(xiàn),說明低應(yīng)力可能對(duì)軟骨退變修復(fù)有抑制作用。國(guó)內(nèi)顧氏等將大鼠一側(cè)后肢跟腱切除約2mm,術(shù)后允許動(dòng)物自由活動(dòng),術(shù)后1周至1個(gè)月,軟骨未見異常改變;術(shù)后2個(gè)月,部分軟骨出現(xiàn)裂隙,多集中于軟骨的淺表,正常軟骨細(xì)胞柱存在,有少量固縮的軟骨細(xì)胞;術(shù)后3個(gè)月軟骨裂隙增多,有些可深達(dá)鈣化層,部分區(qū)域有軟骨小片缺損,軟骨細(xì)胞排列紊亂,較多軟骨細(xì)胞發(fā)生退變,并有空陷窩出現(xiàn),某些區(qū)域有軟骨細(xì)胞族出現(xiàn);術(shù)后5~8個(gè)月,上述改變程度更明顯,軟骨細(xì)胞柱正常形態(tài)消失。

3)增加骨內(nèi)壓  自1983年Larsen次提出骨內(nèi)壓概念后,國(guó)外對(duì)骨內(nèi)壓與OA的關(guān)系有了較詳盡的研究,提出導(dǎo)致骨內(nèi)壓上升的主要原因是由各種因素引起的骨內(nèi)靜脈回流受阻所致的骨內(nèi)靜脈血淤積。據(jù)于此,有人結(jié)扎大鼠股靜脈并切除1cm,且切斷髂內(nèi)靜脈和躁部至膝部的大隱靜脈,8周后可見關(guān)節(jié)軟骨的鈣化層增厚,新骨形成,松質(zhì)硬化,與臨床OA的變化相似。結(jié)扎犬膝關(guān)節(jié)周圍的靜脈可導(dǎo)致關(guān)節(jié)軟骨的局部損傷和變性。通過結(jié)扎家兔一側(cè)股、臀下靜脈造成膝關(guān)節(jié)周圍骨內(nèi)高壓動(dòng)物模型,1周時(shí)關(guān)節(jié)軟骨出現(xiàn)退變。許氏等認(rèn)為這種方法造模12周時(shí)關(guān)節(jié)軟骨僅呈輕微病變,與臨床表現(xiàn)不太相符,而采用在結(jié)扎股、臀下靜脈的同時(shí)行同側(cè)肢體伸膝固定的2種方法疊加造模,既能使膝旁周圍靜脈瘀滯,骨內(nèi)壓升高,又能使兔膝關(guān)節(jié)發(fā)生退行性改變,術(shù)后6周模型即可建成,造模成功率高。而且可以觀察到兔膝關(guān)節(jié)明顯退變、軟骨表層明顯缺損、關(guān)節(jié)軟骨潰瘍、軟骨細(xì)胞紊亂和軟骨細(xì)胞丟失、纖維化及少量骨贅形成等,符合人類骨關(guān)節(jié)炎的病理改變。

2.3 藥物注射誘發(fā)骨關(guān)節(jié)炎模型

1.木瓜蛋白酶(Papain)  Papain是一種蛋白水解酶,將其分別注入家兔膝、髖關(guān)節(jié)中,并加以局部制動(dòng),觀察到關(guān)節(jié)軟骨退行性變的發(fā)生。楊氏等用1.6%Papain 0.3ml注入日本大耳兔顳頜關(guān)節(jié)控制內(nèi),2, 4, 6周后,分別進(jìn)行病理學(xué)觀察,發(fā)現(xiàn)關(guān)節(jié)軟骨變薄,表面糜爛、腐蝕,軟骨細(xì)胞壞死,軟骨基質(zhì)破壞等一系列的病理性改變,這種模型與人類OA病理變化極為相似,且易于復(fù)制。同樣,用4%Papain 0.3ml注射到家兔髖關(guān)節(jié)中也成功地復(fù)制出OA模型,且骨關(guān)節(jié)炎發(fā)生時(shí)間短,重復(fù)性好。

2.膠原酶  膠原酶是一種金屬蛋白酶,能夠分解細(xì)胞間基質(zhì)的膠原蛋白。Kikuchi等利用膠原酶注入兔膝關(guān)節(jié)腔內(nèi),6周后發(fā)現(xiàn)骨的邊緣比中間更為嚴(yán)重,軟骨的退變隨時(shí)間的推移而逐漸加重,且與膠原酶劑量呈正相關(guān),這種關(guān)節(jié)軟骨的退變與人類OA病理相類似,并認(rèn)為在短時(shí)間內(nèi)這種造模方法比木瓜蛋白酶更易誘導(dǎo)OA。

3.雌二醇  雌二醇可導(dǎo)致關(guān)節(jié)軟骨受損,實(shí)驗(yàn)研究發(fā)現(xiàn),在家兔和狗的關(guān)節(jié)軟骨細(xì)胞內(nèi)存在17-β雌二醇受體,表明雌激素與OA發(fā)生有密切關(guān)系。Tsai等將雌二醇按0.3mg/(kg·d)的劑量注入兔膝關(guān)節(jié)腔內(nèi),9周后發(fā)現(xiàn)兔股骨髁表面關(guān)節(jié)軟骨變薄,軟骨面龜裂、纖維化;12周后關(guān)節(jié)軟骨侵蝕破壞擴(kuò)展到鈣化層,軟骨下骨外露,電鏡掃描進(jìn)一步提示,軟骨細(xì)胞變形嚴(yán)重呈不規(guī)則狀,細(xì)胞核深度凹陷窩出現(xiàn)及囊泡形成。

4.聚乙烯亞胺  OA早期,蛋白多糖在關(guān)節(jié)軟骨新陳代謝過程中退變和變異對(duì)OA的發(fā)生起關(guān)鍵作用。因此, Sakano等將陽離子聚乙烯亞胺注射到鼠膝關(guān)節(jié)腔內(nèi),用以阻擋膝關(guān)節(jié)軟骨陰離子區(qū)域,2, 4, 6個(gè)月后觀察發(fā)現(xiàn),膝關(guān)節(jié)明顯變形,蛋白多糖退變和功能減退,且逐漸加重,晚期發(fā)展成為典型的OA模型。這種OA模型的誘導(dǎo)與聚乙烯亞胺分子量呈正相關(guān)。此外,菲律賓素(Filipin)、腎上腺皮質(zhì)激素、透明質(zhì)酸、軟骨碎片等注入家兔膝關(guān)節(jié)腔內(nèi),也可導(dǎo)致關(guān)節(jié)軟骨退變,誘發(fā)OA模型。

2.4 骨關(guān)節(jié)炎轉(zhuǎn)基因動(dòng)物模型

(1)復(fù)制方法  OA是一種由多種原因所致的慢性退行性關(guān)節(jié)病變,以關(guān)節(jié)軟骨變性、破壞及骨質(zhì)增生為主要特征。主要復(fù)制方法是:通過轉(zhuǎn)基因和基因敲除技術(shù)獲得自發(fā)性O(shè)A動(dòng)物模型。

(2)模型特點(diǎn)  ①Ⅱ型前膠原基因缺陷小鼠模型  正常軟骨基質(zhì)膠原以Ⅱ型為主,Ⅱ型膠原合成障礙與OA發(fā)病有關(guān)。OA軟骨細(xì)胞Ⅱ型膠原合成功能受損,Ⅰ型膠原合成增加,因此,OA關(guān)節(jié)軟骨膠原纖維構(gòu)成更近似于皮膚和骨的膠原纖維,從而導(dǎo)致軟骨表層膠原纖維直徑變大,分布不規(guī)則,對(duì)軟骨的保護(hù)作用減弱。據(jù)報(bào)道Ⅱ型前膠原基因點(diǎn)突變(半胱氨酸取代519位精氨酸,Arg→Cys 519)可導(dǎo)致家族性的OA,具全身性、侵蝕性及早發(fā)的特點(diǎn),呈常染色體顯性遺傳,并伴有輕度的脊柱軟骨發(fā)育不良。對(duì)兒童早發(fā)OA病例的調(diào)查也發(fā)現(xiàn)同樣的點(diǎn)突變。表達(dá)人突變Ⅱ型前膠原基因(Arg→Cys 519)轉(zhuǎn)基因小鼠模型比正常對(duì)照體積小、有腭裂且生長(zhǎng)板紊亂,電鏡下觀察軟骨示Ⅱ型膠原纖維密度降低,軟骨細(xì)胞高爾基體囊擴(kuò)張。以上改變類似于含Ⅱ型前膠原(COL-A1)突變基因患者所表現(xiàn)出的早發(fā)全身OA和軟骨發(fā)育不良。COL-A1基因剔除小鼠模型同樣存在軟骨缺陷,該品系低齡小鼠表型與人類軟骨發(fā)育異常類似,表現(xiàn)形式多樣,可出現(xiàn)軟骨基質(zhì)膠原纖維數(shù)量減少、軟骨細(xì)胞粗面內(nèi)質(zhì)網(wǎng)擴(kuò)張、生長(zhǎng)發(fā)育障礙,骨密度減低、易于骨折等;而高齡小鼠(15個(gè)月)則表現(xiàn)出典型的OA樣軟骨退行性變。研究發(fā)現(xiàn),含失活的COL-A1等位基因的小鼠在15個(gè)月齡時(shí),OA的發(fā)生率為60%~90%,而正常對(duì)照組只有20%~45%(P<0.01)。踩輪運(yùn)動(dòng)能降低其OA的發(fā)生率,但對(duì)正常小鼠OA的發(fā)生無影響。這可能與運(yùn)動(dòng)使關(guān)節(jié)軟骨膠原纖維網(wǎng)重排和加強(qiáng)有關(guān)。

②雙糖鏈蛋白多糖P纖維調(diào)節(jié)素相關(guān)基因缺陷小鼠模型  雙糖鏈蛋白多糖是富含亮氨酸的Ⅰ類小分子蛋白多糖(SL-RP),其編碼基因位于Xq28-ter,與核心蛋白多糖(decorin,另一種Ⅰ類SLRP)編碼基因同源。雙糖鏈蛋白多糖在靠近N末端部位連有2條硫酸軟骨素氨基葡聚糖鏈,而核心蛋白多糖只有1條。纖維調(diào)節(jié)素是Ⅱ類SURP,在骨、軟骨組織和肌腱中表達(dá)較高。研究表明,雙糖鏈蛋白多糖基因敲除小鼠骨前體細(xì)胞形成障礙且對(duì)TGF2β反應(yīng)低下,膠原合成減少,細(xì)胞凋亡增加。雙糖鏈蛋白多糖P纖維調(diào)節(jié)素基因聯(lián)合缺陷小鼠肌腱膠原纖維在結(jié)構(gòu)和機(jī)械性能上均發(fā)生改變,引起關(guān)節(jié)不穩(wěn)定,出現(xiàn)步態(tài)改變、肌腱異位鈣化,導(dǎo)致發(fā)生嚴(yán)重早發(fā)并快速進(jìn)展的OA;如受累關(guān)節(jié)被迫運(yùn)動(dòng),則病理改變更為明顯。

(3)比較醫(yī)學(xué)  臨床人類骨關(guān)節(jié)炎發(fā)病與年齡、體重、炎癥、外傷、遺傳等多種因素有關(guān),無明顯地域及種族差異,它是人類致殘的重要病因之一。目前,臨床上對(duì)OA尚缺乏有效的*措施,通過建立理想的OA動(dòng)物模型,來開展其發(fā)病機(jī)制、藥物治療方面的實(shí)驗(yàn)研究是研究OA的重要方法之一。

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