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血栓性疾病動物模型

更新時間:2018-09-13點擊次數(shù):3223

血栓性疾病動物模型

正常情況下,機體內(nèi)的血液在血循環(huán)內(nèi)呈液體狀態(tài),是由于體內(nèi)存在著相互拮抗的凝血和抗凝血系統(tǒng)。當(dāng)機體受到某些物理和化學(xué)因素的作用,或本身有創(chuàng)傷和感染時,可引起機體免疫和代謝功能發(fā)生改變,造成體內(nèi)凝血和抗凝血系統(tǒng)功能紊亂,終導(dǎo)致血栓形成。血栓形成主要涉及心血管內(nèi)皮、血流狀態(tài)和凝血反應(yīng)三方面的改變,這三種條件通常合并存在,但常以某一條件為主。此外,當(dāng)機體血液處于高凝狀態(tài)時,如DIC、手術(shù)、創(chuàng)傷、妊娠等引起的血液凝固性增高也是血栓形成的原因之一。臨床上血栓性疾病對患者危害,甚至可危及人的生命,所以加強血栓形成機制、血栓臨床診斷、抗血栓藥物方面的研究具有重要意義,這些研究均需要建立理想而實用的血栓動物模型。

1 體外血栓模型

(1)復(fù)制方法  取靜脈血,注入體外旋轉(zhuǎn)圓塑料環(huán)內(nèi),在體外血栓儀上以17.5r/min轉(zhuǎn)動10min,然后取下塑料環(huán),將血栓倒在濾紙上吸干水分,測量血栓長度、濕重及干重。

(2)模型特點  模型制作方法操作簡便,可直接觀察血栓形成過程、測定纖維蛋白血栓形成時間和特異血栓形成時間。本模型適用于抗栓抗凝藥物的藥理研究,亦可作藥物溶栓作用的研究。

(3)比較醫(yī)學(xué)  采用體外旋轉(zhuǎn)圓環(huán)內(nèi)模擬機體內(nèi)的血流狀態(tài)以形成血栓。當(dāng)轉(zhuǎn)環(huán)在沿垂直平面上順時針方向旋轉(zhuǎn)時,可在上下彎月面形成一個既有回流又有二次流的復(fù)雜流動區(qū),為血小板聚集及血栓形成提供了有利條件。本模型形成的人工血栓同機體內(nèi)自然形成的血栓在組織結(jié)構(gòu)上相似。

2 半體內(nèi)血栓動物模型

(1)復(fù)制方法  成年實驗大鼠,按30mg/kg體重的劑量經(jīng)腹腔注射戊丨巴丨比丨妥丨鈉麻醉,麻醉后將大鼠仰臥固定于手術(shù)臺上,頸部皮膚常規(guī)消毒與去毛。無菌手術(shù)于頸部正中作一切口,鈍性分離出左頸動脈及右頸外靜脈,再取兩根聚乙烯管,分別插入左頸動脈和右頸外靜脈,然后套上另一內(nèi)有絲線的聚乙烯套管,以便形成大鼠頸動靜脈回路。術(shù)畢,立即拔下套管,取出絲線用濾紙吸干殘血,精密稱重。

(2)模型特點  制作方法簡單、經(jīng)濟,是目前國內(nèi)常用的血栓動物模型。

(3)比較醫(yī)學(xué)  當(dāng)模型大鼠頸動靜脈回路建立后,其血流中的血小板接觸旁路循環(huán)中的絲線粗糙面時,可發(fā)生黏附、聚集,血小板聚集物環(huán)繞絲線表面形成血栓。本方法形成的血栓結(jié)構(gòu)類似于動脈中的白色血栓。用藥物抑制此類血栓形成,除受血流速度和血液黏度因素影響外,主要與藥物抑制血小板黏附和聚集功能有關(guān)。

3 體內(nèi)血栓動物模型

1.物理刺激法

(1)機械性損傷兔血栓模型

①復(fù)制方法  體重約為2.5kg的新西蘭兔,按30mg/kg體重的劑量經(jīng)耳緣靜脈注射戊丨巴丨比丨妥丨鈉麻醉,麻醉后將兔仰臥固定于手術(shù)臺上。用無菌手術(shù)分離其一側(cè)股深動脈,選擇直徑為1mm的股深動脈血管段,用動脈夾夾住上下兩端,中間留有1.5cm長的血管段為手術(shù)部位。在體視顯微鏡下,用7號針頭從血管段上端沿血管向下刺入血管段內(nèi),并順勢注入生理鹽水沖凈血管內(nèi)的血液,然后抽出針頭,再用6號微型刮匙沿刺破孔進(jìn)入血管,反復(fù)搔刮血管內(nèi)膜。搔刮深度以0.5~0.7cm為宜,搔刮范圍盡可能大些,以刮出少量血管內(nèi)膜為宜。稍等片刻后,松開遠(yuǎn)端動脈夾,使血液充盈血管;待刺孔不滲血時,再取下血管兩端血管夾,觸摸家兔膝內(nèi)側(cè)皮下支動脈搏動示血管通暢后,常規(guī)手術(shù)逐層縫合,關(guān)閉皮膚切口。

②模型特點  術(shù)后24h模型動物即開始有血栓形成。模型制作方法簡便,容易操作,重復(fù)性好,模型成功率高,但造模過程較費時。采用本方法也可制備靜脈血栓模型。    ③比較醫(yī)學(xué)  本模型造模機制同人類血栓形成極為相似,當(dāng)刮匙搔刮損傷動物血管內(nèi)膜后,可使血管內(nèi)皮下細(xì)胞外基質(zhì)(ECM)裸露,促使血小板與ECM(主要是膠原纖維)接觸而被激活和黏附;同時裸露的膠原纖維激活因子及損傷的內(nèi)皮細(xì)胞可釋放出組織因子,進(jìn)一步啟動機體內(nèi)源性和外源性凝血過程,導(dǎo)致血栓形成。本模型適用于動態(tài)觀察血栓形成過程中血栓形態(tài)及血栓變化規(guī)律以及評價藥物溶栓作用的實驗研究,也適用于與形成和溶解血栓有關(guān)的其他實驗研究。

(2)電流刺激誘導(dǎo)大鼠血栓模型

①復(fù)制方法  成年實驗大鼠,按30mg/kg體重的劑量經(jīng)腹腔注射戊丨巴丨比丨妥丨鈉麻醉,麻醉后將大鼠仰臥固定于手術(shù)臺上,頸部皮膚常規(guī)消毒與去毛。用無菌手術(shù)于頸部正中作一切口,鈍性分離其右側(cè)頸總動脈約15mm長;用兩根直徑為1.3mm,間距1.7mm的不銹鋼棒作為刺激電極,將刺激電極和溫度探子鉤于動脈內(nèi)膜上。采用刺激電流為1.5mA、刺激時間為7min。當(dāng)血栓阻斷動脈血流后,遠(yuǎn)心端動脈溫度驟降,記錄從電刺激開始到溫度驟降所需時間,即為血栓形成時間。

②模型特點  本模型制作方法簡單,容易操作。易受動物年齡、環(huán)境溫度的影響,血栓形成時間不均一,實際應(yīng)用時有局限性。造模過程中需遮蓋手術(shù)切口附近的組織,以避免影響血管壁表面溫度和刺激電極與周圍組織接觸。

③比較醫(yī)學(xué)  通常認(rèn)為,機體內(nèi)動脈血栓產(chǎn)生的決定因素是血管內(nèi)皮損傷及高切率血流(如狹窄),在高切率區(qū)血栓成分主要以血小板為主,而低切率區(qū)則以纖維蛋白和紅細(xì)胞為主。而靜脈血栓產(chǎn)生的決定因素則是內(nèi)皮損傷,血液淤積呈高凝狀態(tài),其血栓主要成分是纖維蛋白、紅細(xì)胞、少量的血小板及白細(xì)胞。本模型造模機制為當(dāng)直流電刺激頸動脈壁時可造成血管損傷,使血管內(nèi)膜變得粗糙不平,引起血小板黏附、聚集,并釋放一系列活性物質(zhì),激活機體內(nèi)源性凝血系統(tǒng);同時受損血管內(nèi)膜釋放的組織凝血活素又可激活機體外源性凝血系統(tǒng),導(dǎo)致動脈管腔內(nèi)逐漸形成肉眼可見的混合血栓。本模型形成的血栓成分在電刺激區(qū)主要以血小板及纖維蛋白為主,并可見少量紅細(xì)胞及白細(xì)胞;而在電刺激遠(yuǎn)端則以纖維蛋白及紅細(xì)胞為主。采用本方法復(fù)制的大鼠動脈血栓與人類動脈血栓在組織形態(tài)結(jié)構(gòu)上相似,適用于作抗血栓形成藥物篩選方面的研究。

(3)光化學(xué)誘導(dǎo)大鼠血栓模型

①復(fù)制方法  成年實驗大鼠,按30mg/kg體重的劑量經(jīng)腹腔注射戊丨巴丨比丨妥丨鈉麻醉,麻醉后將大鼠側(cè)臥固定于手術(shù)臺上,頭部皮膚常規(guī)消毒與去毛。用無菌手術(shù)經(jīng)左側(cè)顳部入路,于左眼外眥和左耳外耳道連線上近眼外眥1/3處作一垂直長約2cm的弧形切口,分離顳肌并去除顴弓,用拉鉤拉開下頜關(guān)節(jié),在卵圓孔前上方用牙科鉆鉆一直徑為5mm的骨窗,切開硬腦膜即可見大腦中動脈(MCA),選擇MCA的近端(起始部)和從嗅束至大腦下靜脈間的一段MCA為光照部位,將自制LG-150B冷光源的光纖端口置于距MCA表面約5mm處,將光纖所射出的光束垂直對準(zhǔn)MCA。先將光纖移至MCA起始部,經(jīng)股靜脈注入1.5%虎紅B(四碘四氯熒光素鈉)5min后,注射劑量為2ml/kg體重,再持續(xù)光照10min;然后將光纖移到嗅束至大腦下靜脈段MCA表面,再注入半量虎紅B,仍持續(xù)照射10min,即可制備成功血栓模型。

②模型特點  模型制作過程中采用分離顳肌、拉開下頜關(guān)節(jié)的方法,既可保留術(shù)后模型大鼠的咀嚼功能,又能提高模型動物的存活率。同時采用分步照射法,并在兩次注射光敏劑時劑量減半,可避免動物損傷程度過重,從而制備出較為實用可靠的大腦中動脈血栓模型。本方法制備的血栓模型穩(wěn)定,結(jié)果可靠,成功率高。

③比較醫(yī)學(xué)  本模型的造模機制是由于虎紅B在單色綠光下可產(chǎn)生并釋放單態(tài)氧,導(dǎo)致血管內(nèi)皮細(xì)胞膜上的不飽和脂肪酸發(fā)生脂質(zhì)過氧化反應(yīng),造成細(xì)胞膜的通透性發(fā)生改變,Ca2+內(nèi)流增加;同時脂質(zhì)過氧化物增加又可破壞機體內(nèi)前列環(huán)素(PGI2)與血栓素B2(TXB2)的平衡,促進(jìn)血管內(nèi)的血小板聚集與黏附,激活凝血過程,形成血栓并進(jìn)一步阻塞血管導(dǎo)致缺血;在凝血過程中可產(chǎn)生大量血管活性物質(zhì)及神經(jīng)毒性物質(zhì),這些物質(zhì)可破壞腦細(xì)胞尤其是血一腦脊液屏障,致病機制與人類腦梗死發(fā)生極為相似。本模型的血栓形成過程與臨床上人類腦血栓形成在發(fā)病機制、血栓形成過程、損害程度方面較為相近,造模方法對模型動物血管本身無機械性損害,可應(yīng)用于臨床上腦血管病的發(fā)病機制、藥物篩選及康復(fù)醫(yī)學(xué)的實驗研究。

2.化學(xué)藥物誘導(dǎo)法

(1)胰蛋白酶血栓形成法

①復(fù)制方法  體重約為2.5kg的新西蘭兔,按30mg/kg體重的劑量經(jīng)耳緣靜脈注射戊丨巴丨比丨妥丨鈉麻醉,麻醉后將兔仰臥固定于手術(shù)臺上。頸部皮膚常規(guī)消毒與去毛。用無菌手術(shù)于頸部正中作一切口,鈍性分離暴露右側(cè)頸總動脈約2.5cm,用顯微外科動脈夾夾住頸總動脈近心端和遠(yuǎn)心端,兩端分別插入8號針頭,在針頭進(jìn)入部位結(jié)扎血管,兩端結(jié)扎線相距1.5cm;經(jīng)近心端針頭用輸液泵勻速(0.6ml/min)灌注1.0%胰蛋白酶15min。然后以相同速度灌注生理鹽水沖洗并經(jīng)遠(yuǎn)心端排出,后拔出針頭用無創(chuàng)傷性針線縫合針孔。手術(shù)閉,放開動脈夾使血流復(fù)通。

②模型特點  模型制作方法簡便、可靠,重復(fù)性好。

③比較醫(yī)學(xué)  模型造模機制:由于胰蛋白酶具有蛋白水解作用,其進(jìn)入模型動物機體后可使血管內(nèi)膜和部分肌層脫落,造成血小板黏附、聚集,終導(dǎo)致血栓形成。本模型所形成的血栓組織形態(tài)結(jié)構(gòu)富含血小板和纖維蛋白,與臨床上動脈血栓形成相似,可用于抗血栓藥物療效觀察和篩選方面的研究。

(2)過氧化氫(H2O2)血栓形成法

①復(fù)制方法  體重約為2.5kg的新西蘭兔,按30mg/kg體重的劑量經(jīng)耳緣靜脈注射戊丨巴丨比丨妥丨鈉麻醉,麻醉后將兔仰臥固定于手術(shù)臺上。頸部皮膚常規(guī)消毒與去毛。用無菌手術(shù)于頸部正中作一切口,鈍性分離暴露其一側(cè)頸總動脈,用兩個顯微外科動脈夾夾閉頸總動脈,夾間距離約為2.5cm,用4號針頭刺入動脈并結(jié)扎固定,用針筒迅速抽出動脈夾之間動脈內(nèi)的殘留血液,并用生理鹽水反復(fù)沖洗3~4次,直至動脈段內(nèi)無殘血。然后用10%過氧化氫(H2O2)溶液0.4ml分4~5次注入動脈段內(nèi)連續(xù)作用10min,再用生理鹽水沖洗2~3次后,用黏合膠黏合針孔,放開動脈夾恢復(fù)血流。

②模型特點  模型制作方法簡單、效果可靠,形成的血栓主要為白色血栓,符合臨床動脈血栓的特征。

③比較醫(yī)學(xué)  模型造模機制:過氧化氫進(jìn)入機體血管后可損傷血管內(nèi)膜,并引起血小板黏附、聚集,終導(dǎo)致血栓形成。本模型適用于探索預(yù)防血栓形成方法方面的研究。

(3)三氯化鐵(FeCl3)血栓形成法

①復(fù)制方法  成年實驗大鼠,按30mg/kg體重的劑量經(jīng)腹腔注射戊丨巴丨比丨妥丨鈉麻醉,麻醉后將大鼠側(cè)臥固定于手術(shù)臺上,頭部皮膚常規(guī)消毒與去毛。用無菌手術(shù)自眼眥和外耳道中線處剪一切口,除去顴弓,暴露顳前窩及鱗狀骨大部分,隨后在顴弓和鱗狀骨前聯(lián)合的前下方約2mm處用牙科鉆一直徑約2mm的小顱窗,暴露大腦中動脈(MCA),用一小片塑料薄膜保護血管周圍組織。將吸有50%三氯化鐵(FeCl3)溶液10μl的小片濾紙敷在暴露的大腦中動脈上20min,共敷兩次后去掉濾紙。再用生理鹽水沖洗局部組織,常規(guī)手術(shù)逐層縫合。

②模型特點  模型動物形成的動脈血栓為混合血栓,主要成分為血小板、紅細(xì)胞及纖維蛋白等。模型制作方法簡單、可靠,重復(fù)性好,但由于造模時需去除顴弓,影響動物進(jìn)食,不利于作長期觀察。

③比較醫(yī)學(xué)  本模型利用鐵離子進(jìn)入機體血管后,可作用于血管壁造成血管內(nèi)膜損傷,血小板黏附、聚集,終形成血栓的原理建立。模型制作過程中仍保留有大腦中動脈,可進(jìn)行血管動態(tài)觀察,比較接近于臨床患者的實際情況,本模型適用于抗栓藥物和溶栓藥物的篩選及療效觀察,還適用于TTC染色技術(shù)直觀地觀察腦梗死程度。

3.血栓誘導(dǎo)法

(1)復(fù)制方法  成年雄性KM小鼠或SD大鼠,將角叉菜膠用生理鹽水配制成0.1%和1%溶液后,經(jīng)小鼠腰背部和大鼠后肢足跖部皮下注射。注射3~14h后,大多數(shù)模型動物的尾尖部可出現(xiàn)暗紅色血栓形成區(qū),并逐漸向尾根部擴大;注射48~72h后局部可從發(fā)紺變?yōu)楹谏?,隨后尾部干細(xì)斷落。

(2)模型特點  注射24h后,模型動物尾部小靜脈和毛細(xì)血管內(nèi)含有大量纖維素,以及少量白細(xì)胞及血小板,血管內(nèi)皮細(xì)胞核濃縮呈骰子狀,血管內(nèi)壁中性粒細(xì)胞靠邊;72h時可見較大血管呈炎癥改變并伴有混合性血栓形成。由于血栓發(fā)生在尾部且界限明顯,可從體表直接觀察血栓形成出現(xiàn)的時間與發(fā)展過程,并能測量血栓形成波及的范圍或長度,可為研究體內(nèi)血栓形成全過程提供一個簡便、直觀的動物模型。模型制作方法簡單,結(jié)果可靠,重復(fù)性好。

(3)比較醫(yī)學(xué)  模型制作使用的角叉菜膠是從海藻中提取的含硫酸多糖物質(zhì),也是一種較強的致炎物質(zhì),其誘發(fā)的動物尾動脈局部血栓與血管內(nèi)炎癥密切相關(guān)。由于炎癥時可釋放大量炎癥介質(zhì)如白細(xì)胞介素-1、腫瘤壞死因子等,它們可破壞正常血管內(nèi)皮細(xì)胞維持凝血與纖溶之間的平衡作用,從而促發(fā)動物血栓形成。同時血管內(nèi)皮細(xì)胞損傷時可造成某些舒血管物質(zhì)如乙酰膽堿等分泌減少,縮血管物質(zhì)如內(nèi)皮素等增多,引起局部血管痙攣,從而加重局部血管的缺血缺氧狀況,進(jìn)一步促進(jìn)血栓形成及血管內(nèi)皮損傷。本模型適用于臨床上抗血栓藥物療效觀察和篩選方面的研究。

4.手術(shù)法

(1)犬股動脈異物法血栓模型

①復(fù)制方法  體重約為10kg的雄性實驗犬,按30mg/kg體重的劑量經(jīng)靜脈注射戊丨巴丨比丨妥丨鈉麻醉,麻醉后將犬仰臥固定于手術(shù)臺上。用無菌手術(shù)分離其一側(cè)股動脈約7cm,在其兩端用顯微外科動脈夾夾閉,夾間距離約為3.5cm,沿股動脈遠(yuǎn)心端向近心端方向在夾閉段股動脈內(nèi)安插直徑為0.5cm、長度為1.5cm的單股螺旋鋼絲,進(jìn)入血管內(nèi)腔后結(jié)扎固定,行血管縫合術(shù),再用醫(yī)用生物黏合膠黏合。放開動脈夾,恢復(fù)血流暢通,確定手術(shù)視野無滲血后,常規(guī)手術(shù)逐層縫合。

②模型特點  制作方法簡單易行,可靠性強,重復(fù)性好。

③比較醫(yī)學(xué)  在模型動物股動脈內(nèi)放置螺旋鋼絲線圈,可造成動脈內(nèi)膜損傷,造成局部血流動力學(xué)改變,進(jìn)一步激活機體凝血系統(tǒng),促進(jìn)血小板凝集并釋放一系列活性物質(zhì),終導(dǎo)致血栓形成。本模型形成的血栓主要由血小板、白細(xì)胞及纖維蛋白構(gòu)成,目前多用于血栓放射免疫顯像方面的研究。

(2)大鼠結(jié)扎法

①復(fù)制方法  成年實驗大鼠,按30mg/kg體重的劑量經(jīng)腹腔注射戊丨巴丨比丨妥丨鈉麻醉,麻醉后將大鼠側(cè)臥固定于手術(shù)臺上,腹部皮膚常規(guī)消毒與去毛。無菌手術(shù)開腹,分離其下腔靜脈,于左腎靜脈下方用粗絲線結(jié)扎下腔靜脈,然后縫合腹壁;結(jié)扎2~6h后重新打開腹腔,在結(jié)扎線下方2cm處用血管夾夾閉血管,剖開管腔并取出血栓,于60℃烘干后稱量血栓質(zhì)量,以血栓質(zhì)量或血栓形成百分率作為評價指標(biāo)。

②模型特點  采用本方法通常在結(jié)扎后2h,模型動物血栓形成率可達(dá)到60%~80%,此時處死動物主要觀察血栓形成百分率;結(jié)扎6h后模型動物血栓形成率為100%,此時主要觀察血栓質(zhì)量。模型制作方法簡單易行,重復(fù)性好,效果可靠,成功率高。

③比較醫(yī)學(xué)  用粗絲線結(jié)扎大鼠下腔靜脈,可引起局部血流淤滯、缺氧,造成血管內(nèi)皮細(xì)胞損傷,從而啟動內(nèi)源性凝血系統(tǒng);同時,血管內(nèi)黏聚的血小板與局部形成的凝血因子因血流受阻滯留在局部,終導(dǎo)致血栓形成。本模型多用于溶栓藥物體內(nèi)抗血栓作用的評價。

目前,隨著臨床上血栓性疾病的發(fā)病率逐年增高,如何開展有效的診斷、預(yù)防和治療,已引起國內(nèi)外臨床醫(yī)學(xué)界的廣泛關(guān)注。建立各種血栓性疾病動物模型用于實驗研究已成為重要手段,迄今為止已形成了許多動物血栓模型的建立方法。由于各種血栓模型均有各自的特點,因此應(yīng)根據(jù)研究目的和需要來選擇合理的血栓動物模型制作方法,如機械損傷法、股動脈異物法、電流損傷法、胰蛋白酶血栓形成法、過氧化氫法、角叉菜膠血栓形成法等適用于作動脈血栓的研究;機械損傷法、結(jié)扎法則適用于作靜脈血栓的研究;而腦栓塞的研究則可選擇三氯化鐵血栓形成法和光化學(xué)法,以免事倍功半。

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